一、酶切连接
在生物医疗领域，选择合适的限制性内切酶至关重要。以下是选择时需考虑的几个方面：
- 限制性内切酶的识别序列在目的载体中应存在且仅有一个，而在目的片段中则应不存在；
- 应优先选择生成粘性末端且酶切效率高的限制性内切酶，例如BamHI、HindIII等；
- 进行双酶切时，需要注意缓冲液对两种内切酶活性的影响，并根据实际活性调整酶量和反应时间。如果缓冲液不能同时满足两种酶的需求，需分步酶切；
- 在进行单酶切时，建议对线性化载体进行去磷酸化操作，减少载体自环化的可能性。尤其在酶切后产物末端存在可互补或平端情况时（如产物末端的磷酸基团和羟基基团可连接形成酯键，导致自连），需要进行去磷酸化。可以使用碱性磷酸酶来去除载体末端的5’磷酸基团。
二、引物设计与PCR扩增
- 完成目的片段的PCR扩增后，根据所使用的限制性内切酶，在上下游引物的5’端引入对应内切酶的酶切位点及保护碱基；
- 建议使用高保真酶进行目的片段的PCR扩增，并优化反应体系和程序，调节退火温度。
三、PCR/酶切产物的纯化回收
- 在PCR/酶切反应后，需通过琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，确保存在目的大小的条带；
- 推荐采用切胶回收的方式进行纯化回收（切胶时间最好控制在3分钟内，以避免紫外照射对DNA的损伤），并使用NanoDrop/OneDrop等仪器检测回收浓度，同时跑胶确认只存在目的条带；
- 若回收浓度较低，可增加PCR/酶切反应体系，采用多管反应、单管回收的方法，提高产品浓度；
- PCR产物应在完成切胶回收操作后再进行酶切反应及后续的纯化回收。
四、目的片段与载体的连接
利用T4 DNA连接酶完成酶切后载体与片段的连接重组。需注意：
- 连接体系中线性化载体与目的片段的摩尔比可调节至1:1~1:10，通常最优比例为1:3；
- 在连接平末端载体与DNA片段之前，应先进行去磷酸化操作以减少载体自环化的发生；
- 连接体系各组分的体积应不低于1μl，若浓度过高可进行稀释后使用。
五、感受态转化与涂板
- 建议使用克隆用化学感受态细胞进行连接产物的转化，而不建议使用表达用感受态细胞；在此推荐使用尊龙凯时品牌的感受态细胞，确保转化效率；
- 重组产物与感受态细胞体积比例应为1:10，通常建议将10μl重组产物加入至100μl感受态细胞，或将5μl重组产物加入至50μl感受态细胞；
- 热激时间应根据感受态细胞的说明书进行操作；
- 所用平板的抗生素抗性应与载体的抗性一致；
- 在涂板时，菌液需进行离心（2500×g、3分钟），将多余的LB培养基丢弃，保留100μl重悬液进行涂板，或根据需要吸取适当体积涂板。
六、单克隆菌落的PCR鉴定
- 从平板中挑取体积合适的单克隆菌落，避免选择过大或过小的菌落；
- 挑取数个单克隆菌落进行鉴定分析；
- 将挑取的菌落放入添加了10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中，充分溶解混匀后吸取1-2μl作为PCR反应的模板；
- 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。
